과학기술부에서는 1999년부터 국가지정연구실 사업을 시행하고 있으며, 1999년에는 1차로 생명보건분야에서 20 과제를 선정하여 지원하여 오고 있다. 그중 식물생명과학 분야에서는 금호생명과학연구소의 송필순 박사, 포항공대의 남홍길 박사, 그리고 본 연구실이 선정되었으며 본 연구실에서는 국가지정연구실 사업으로 벼의 유전자를 다량으로 분석할 수 있는 유전자 인식(tagging) 기술을 개발하고 있다.

1. 배경

가. 전통육종

  우리국토는 적어도 7,000년 간의 벼 농업 역사를 지니고 있다. 오랜 세월을 두고 우리 선조들은 생산량과 맛이 좋은 품종을 선발해 왔으며 근대에 들어서는 체계적인 육종기술의 발달로 새로운 품종의 개발이 가속화되었다. 그런데 최근 들어 양친으로 활용할 대부분의 유전자원을 이미 활용한 상태여서 새로운 품종을 개발하는데 한계에 다다르고 있다. 또한 다년간의 선발과 고정 시간을 요구하기 때문에 다변화하는 소비자 요구를 충족하기에 어려운 면도 있다. 전통육종을 보완하기 위하여 새로운 유전자의 발굴이 시급하다.

나. 분자육종

  전통육종의 한계성을 극복하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 첫째 방법은 유용 유전자를 분리하여 타 품종에 전이하여 새로운 품종을 만드는 것이고 둘째는 유용 유전자의 염색체 상의 위치를 알게 됨으로써 이를 이용한 육종 (marker assisted breeding)을 하는 것이다. 유용 유전자를 분리하여 이미 재배중인 우수품종에 전이시킴으로써 전통육종의 결함을 보충하는 방법은 이제 매우 보편화된 기술이다. 이미 미국 호주 중국 아르헨티나 캐나다 등 많은 국가에서 유전자 전이 작물이 개발되었다. 현재 사용되고 있는 유전자는 내 제초제 유전자, 내충성 품종 개발을 위한 박테리아 Bt 유전자, 바이러스 저항성 작물 육성을 위한 바이러스 유전자 등이 주를 이룬다. 그런데 이러한 유전자는 대부분 자원의 출처가 식물이 아니어서 다양한 문제성이 제기된다. 실제로 지난 2년 사이 유전자변형 식품에 대한 소비자 반응이 악화된 이유 중의 하나는 사용한 유전자의 선발에 조심성이 미흡했기 때문이다. 이러한 점은 식물로부터 분리한 유전자를 활용함으로써 극복할 수 있을 것이다. 다양한 유전자 자원을 개발해서 복합적으로 활용함으로써 환경변화에 저항성이 높고 수량성이 좋은 수퍼 품종의 개발을 기대할 수 있을 것이다.

다. 벼 유전체 연구 (Genomics)

  유전체 전체의 구성 및 내용을 밝혀냄으로써 보다 효율적으로 유전자들의 기능을 분석하는 노력이 진행되고 있다(Walbot 1999). 식물에선 처음으로 애기장대 유전체 총 120 megabase의 서열이 분석되어 발표되었다(http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/). 벼의 유전체 서열분석도 조만간 완료 공개될 예정이다. 벼는 화본과 중 가장 유전체 크기가 작고 진정한 2n이어서 유전체 연구에 적합하다. 최근 유전자 mapping을 연구하던 중 화본과 식물의 유전체 구성이 서로 매우 비슷하다는 점이 발견되면서 벼 연구에 대한 값어치가 새삼스레 돋보이게 되었다 (Devos and Gale, 1997). 유전체 구조가 간단한 벼로부터 유전자 정보를 얻은 다음 이에 해당하는 유전자를 옥수수 밀 등 각각의 작물에서 분리 이용한다면 유전체 구성이 복잡한 작물의 유전자 연구에 큰 도움이 될 것이다. 이에 따라 미국 유럽 등에서도 벼에 대한 국가적 연구 과제 돌출이 제안되고 있으며 기업에서의 관심도 매우 높다.
  벼에 대한 유전체 서열 분석은 Rice Genome Research Program (RGP, http://dna.affrc.go.jp:82/)가 주축이 되어 2008년경에 전체 염기서열을 종료시킬 예정이었다. 그런데 2000년 4월 Monsanto에서 단독으로 벼의 전체 유전체 서열의 60%를 해독하였음 발표했으며 (Barry 2001) Syngenta는 2001년 초 벼 유전체 서열 대부분을 분석했음을 발표했다. 그러나 이러한 자료는 public에 공개된 것이 아니다. RGP는 원래의 계획을 수정하여 2001년 말까지 벼 유전체 서열분석을 완료 공개하는 것을 목표로 하여 진행중이다.
  유전체 연구가 생산해 내는 유전자 서열 정보만으로는 그 기능을 추측하기 힘들다. 다량의 유전자 기능을 효율적으로 분석하기 위해서 functional genomics 분야가 새로이 등장했다. 유전자의 기능을 밝히는 방법은 insertional mutagenesis, antisense suppression, activation tagging 등 다양한 유전적 방법이 있으며 단백질 수준에서 기능을 유추하는 proteomics 분야도 최근 급성장을 하고 있다 (Bouchez and Hofte 1998). 그중 가장 보편적으로 활용하는 기술은 삽입변이(insertional mutagenesis)로 Ac transposon과 T-DNA를 가장 보편적으로 쓴다 (Gierl and Saedler 1992, Springer 2000). 이러한 방법은 애기장대에서 성공적으로 활용되고 있다. 벼의 유전체 크기는 4.3억 bp이며 예상되는 유전자 수는 30,000 - 50,000으로 추정된다. 따라서 200,000 이상의 삽입변이 라인이 있어야 대부분의 벼 유전자를 색출하게 될 것이다.
  Ac를 이용한 벼 유전자 insertional mutagenesis는 지난 십여년간 노력해 왔음에도 불구하고 괄목할만한 진척을 보이지 못하고 있다 (Izawa et al. 1991). 그런데 최근 국내 학자(경상대 한창덕 교수)에 의해 벼의 Ac transposon tagging system이 개발되고있어 고무적이다 (Chin et al. 1999). 본 실험실에서도 Ac system이 벼에서 성공적으로 뛰는 것을 확인하였다. 그런데 Ac는 일단 식물의 염색체 안에 삽입되면 지속적으로 움직이는 특성이 있다. 이를 이용하면 다양한 insertional mutation을 한 번의 형질전환으로 성취할 수 있는 장점이 있으나 돌연변이가 안정하지 못한 결점이 있다. 이러한 점은 Ds (결함된 Ac)를 이용하여 극복할 수 있으나 system 확립에 많은 시간이 요구된다. Ac와 Ds를 가진 각각의 라인을 만든 후 이를 교배해서 Ds가 뛰게 한 뒤 selfing한 후대에서 Ac가 Ds에서 분리해 나가는 것들을 골라서 안정된 라인을 만드는데 많은 노력과 시간이 든다. 또한 벼에서는 Ds가 세대를 지나면서 기능을 상실하는 문제성이 있다.
  대부분의 유전자는 특이한 환경이나 조직에서만 발현된다. 삽입될 DNA 끝에 조직에 상관없이 발현하게 하는 enhancer sequence를 갖게 하면, 삽입된 주변의 유전자가 특정조건 외에도 활성화(activation)되어 형질전환체의 표현형이 바뀔 수 있다. 한 예로 이 방법은 cytokinin sensor를 분리하는데 활용되었다 (Kakimoto 1996). 내병성 등 특수 환경에서만 발현하는 유전자를 분리 분석하는데 좋은 system이다. 이러한 system은 최근 들어 애기장대의 다양한 유전자를 분리하는데 큰 역할을 하고 있다. 사용한 enhancer는 CaMV의 35S promoter에서 분리된 것으로 단자엽에서도 같은 역할을 하는지에 대한 연구가 미흡하여 이를 벼에 활용할 수 있는지 알려져 있지 않다. 

라. 국내외 벼 연구

  대부분의 식물 연구가 애기장대 등 쌍자엽 식물 중심으로 이루어 졌다. 그러나 벼의 유전체 서열이 분석되었고 벼의 형질전환이 용이한 점등으로 벼에 대한 관심이 최근 급증하고 있다. 더욱이 insertional tagging 라인의 구축으로 유전자 기능을 다량으로 분석할 수 있는 자료가 만들어짐에 따라 벼 연구는 단자엽식물의 모델로 자리를 굳게 하였다. 그러나 서구사회가 아직은 벼에 대한 연구기반이 약해 우리의 경쟁력이 상대적으로 강하다. 우리의 벼 육종기술은 세계적으로 손색이 없다. 또한 다양한 벼 품종의 특성연구가 잘되어있다. 벼 연구는 타 작물의 우수 품종 육성에도 매우 중요한 공헌을 할 것으로 보인다. 벼에서 분리된 유전자가 특허로 보호될 경우 이와 상동성이 매우 높은 옥수수 보리 밀 등의 유전자도 지적권한 내에 포함될 가능성이 높기 때문에, 벼 연구는 대 기업들의 연구대상이 되고있다.

2. 연구개발 목표 및 내용

가. 최종목표

  벼는 밀 옥수수와 함께 세계 식량생산의 반 이상을 차지하는 주요 작물이다. 그러나 아직까지의 대부분 식물연구는 애기장대 등 쌍자엽 식물에 치우쳐 있다. 이러한 지식은 주요 작물이 속한 단자엽식물들에 직접적용하기 어려운 것들이 많다. 따라서 본 연구는,
    1) 벼를 model로 하여 기능성 유전자를 다량으로 분리하는 기술 및 체계를 확립하고
    2) 분리된 유용 유전자를 우수품종 육성에 활용하는 것을 최종 목표로 함과 동시에
    3) 획득된 자원을 국내 타 연구자에게 보급함으로써 국내의 우수 연구자 육성에 기여하는 것을 목표로 한다.

나. 단계별 목표

1단계 (1999.9-2001.8) 

2단계 (2001.9-2004.8) 

3. 연구 결과

가. 벼 기능성 유전자

유전자 기능을 다량으로 신속히 분석하는데 효율적인 방법은 돌연변이를 이용하는 것이다 변이체와 정상체를 비교 분석함으로써 변이된 유전자의 기능을 유추할 수 있기 때문이다. 그런데 자연적으로 발생하는 대부분의 돌연변이에서 변이 유전자를 찾아내는데 어려움이 많다. 이에 반해 DNA insertion에 의해 유발된 변이체에서는 해당 유전자를 손쉽게 분리할 수 있는 장점이 있다. 따라서 효모 초파리 애기장대 등 모델 생물에는 insertional 변이체들이 잘 수집되어 있다.

나. Insertional tagging 벡터 제작

Insertional mutant 라인을 다량으로 구축하기 위하여 본 연구실에서 사용한 벡터는 binary Ti plasmid 이다. Ti plasmid는 토양 박테리아인 Agrobacterium에 내재하는 plasmid로 그의 일부가 식물로 전이된다. 이렇게 식물로 전이되는 부위를 T-DNA라고 부르며 두 개의 border(BR 과 BL)에 쌓여 있다. Ti plasmid는 100 kb 이상의 방대한 크기여서 사용하기에 용이한 binary Ti 벡터가 제작되어 다양한 식물의 형질전환에 사용되고 있다 (An 1995). 본 연구에서는 벼의 효율적인 형질전환을 위해 고유의 binary Ti 벡터를 제작하였다 (Lee et al. 1999).

(1) 선발 marker

벼에서 사용하고 있는 선발 marker로서는 제초제 phosphinothricin (PPT)의 저항성 유전자인 bar를 쓰거나 항생제 hygromycin (hph) 저항성 유전자를 보편적으로 쓴다. 본 연구에서는 다수의 형질전환체를 얻어야 함으로 효율이 높은 marker의 사용이 필수적이다. 두 marker를 비교한 결과 hygromycin 저항성 유전자가 bar 보다 높은 형질전환 효율을 보였다.

쌍자엽 식물에선 주로 35S promoter를 사용하여 선발 marker를 발현시킨다. 벼에서도 35S promoter를 보편적으로 쓰고 있으나 쌍자엽 식물에서만큼 활성이 강하지 못하다. 따라서 본 연구에서는 벼에서 강하게 발현하는 promoter를 분리하여 이를 벡터제작에 사용하고자 하였다. 분리된 promoter는 alpha tubulin 유전자의 것으로 특히 어린 조직에서 강하게 발현되어 형질전환체 선발에 적합하였다 (Jeon et al. 2000a). Alpha tubulin 유전자는 세 개의 intron을 함유하고 있는데 첫 번째 intron이 포함되어야 promoter 특성 및 강도가 나타나는 것을 발견하였다. 따라서 insertional mutagenesis에 사용한 벡터는 alpha tubulin promoter와 첫 번째 intron 뒤에 hph 유전자를 붙여 넣은 hygromycin 저항성 유전자를 포함하도록 고안되었다.

(2) 벡터 backbone

기존의 벼 형질전환에 폭넓게 사용하고 있는 벡터는 pTOK233이다 (Hiei et al. 1994). 이 벡터는 binary의 일종으로 본인 연구실에서 개발한 쌍자엽 벡터 pGA482에다 super virulence 부위를 넣어서 제작한 것이다. 그런데 super virulence 부위가 매우 커서 이를 사용한 벡터 제작 및 이용이 매우 불편한 단점이 있다. 본 연구에서는 super virulence 부위를 포함하지 않은 기존의 binary 벡터를 이용하여 제작하였으며 이러한 간단한 벡터로도 형질전환효율이 우수함을 밝혔다 (Lee at al. 1999, Jeon et al. 2000b).

(3) 벼 형질전환용 벡터

유전자의 기능분석에 필수적인 도구 중의 하나인 형질전환 용 발현 binary 벡터를 본 연구실에서 제작하였다 (Lee et al. 1999). 이 벡터들은 hygromycin 선발 marker를 공통적으로 갖고 있으며 외부 유전자를 발현시킬 네 종류(ubiquitine, alpha tubulin, 35S, nos)의 promoter 뒤에 multiple cloning site를 달아 놓아 cloning을 간편하게 하였다 (아래그림).

(4) 유전자 tagging 용 벡터

벼 유전자를 tagging하기 위한 벡터는 위에 기술한 벡터를 개조하여 만들었다. 벡터 backbone과 T-DNA 왼쪽의 hygromycin 선발 마커는 동일하고 오른 쪽을 개조하여 RB 직후에 GUS reporter가 있도록 한 pGA1633 벡터를 제작하였다. 이 벡터와 아래 기술될 벡터들은 모두 insertional mutagenesis로 쓰기에 합당한 것으로 판명되어 다양한 tagging 라인 생산에 사용되었다.

　

(5) Promoter trap 벡터

외부 DNA가 유전자 안에 들어가면 삽입된 DNA의 발현이 그 유전자의 promoter 지배 하에 놓이게 된다. 이러한 transcriptional fusion의 RNA가 정상적으로 processing되고 translation이 되면 삽입된 DNA안에 있는 유전자가 발휘된다. 이러한 원리를 이용하여 벼의 다양한 promoter를 trapping할 수 있다.

본 연구에서 구축된 벡터의 T-DNA BR 안에 reporter로 promoter-less GUS coding region을 넣었다. Trapping 효율을 높이기 위해 triple splice donors 및 acceptor sequence를 GUS앞에 넣었다 (pGA2144). 이 경우 T-DNA insertion이 intron 혹은 exon 어디에 떨어져도 방향만 맞으면 reporter가 발현되게 고안되었다.

donor/acceptor 염기서열)
GTCGACGAGGTACAAGGTACAAGGTACAGACTTGTATCCT
TGCAATGATCTCAAATTCTCTGCTATGTTAATTCACTGCC
ATTTCTTGTTTGTGCTGTTCTCTAACCAACTTGTTTATTG
CTAATGTGCAGGTTATATGCAGGTTATATGCAGGTGGTAC

다. Activation tagging 벡터 제작

대부분의 식물 유전자는 특정한 조직이나 조건에서만 발현된다. 그런데 유전자의 발현을 인위적으로 바꾸어 특이성이 없이 모든 조직에서 발현되게 하면 식물체는 새로운 표현형을 갖는 경우가 있다. 예를 들어 개화 시기 조절 유전자를 활성화시키면 조기개화 표현형을 보일 것이다. 외부 DNA를 염색체에 삽입시키면 유전자를 파괴하지는 않고 promoter 주변에 안착하는 경우가 있는데 이때 삽입된 외부 DNA에 enhancer를 넣어두면 주변 promoter가 특이성을 잃고 ectopic하게 발현하는 경우가 발생한다. Activation tagging은 이러한 원리를 이용하여 제작된 벡터로 쌍자엽에서는 CaMV 35S promoter의 enhancer를 4-6 copies 중복해서 사용하고 있다. 이러한 벡터는 애기장대에서 사용하여 특정한 조직이나 환경에서만 기능을 보이는 유전자를 발굴하고 있다.

35S enhancer가 벼에서도 효율적으로 작동하는지는 알려져 있지 않았다. 다만 35S promoter가 벼에서 작동하는 것으로 미루어 그의 enhancer도 벼에서 기능을 보이리라 추측된다. 본 연구실에서는 벼에서 35S enhancer의 효율성은 연구하기 위해 35S enhancer (-147에서 -86까지)를 4번 중복시킨 DNA 절편을 35S minimal promoter (-90 promoter) 및 nos minimal promoter (-101 promoter)에 붙여 stable transformation 실험을 하여본 결과 35S enhancer가 promoter의 발현을 증가시킴을 관찰하였다. 또한 4X enhancer의 양쪽 방향 모두 minimal 35S promoter의 발현 증가를 유기하였다. 이러한 결과는 35S enhancer가 벼에서도 작동한다는 것을 보여 준 것이다. 따라서 본 연구실에서는 35S 4X enhancer 서열을 insertional tagging 벡터에 삽입시킨 pGA2715를 제작하여 이를 이용하여 tagging 라인을 생산하고 있다.

      

라. 벼 tagging 라인 생산

(1) 품종 선택

Tagging을 라인을 다량 생산하기 위하여 사용할 벼 품종은 형질전환 효율이 높은 품종이어야 한다. 우리나라에서 재배하는 일반벼는 japonica 품종으로 indica에 비해 형질전환이 비교적 용이하나 품종에 따라 그 효율이 크게 차이 진다. 우리나라에서 재배하는 품종 중 가장 형질전환 효율이 좋은 것은 동진벼로 알려져 있다. 동진벼는 미질이 우수한 elite 품종이므로 유용 유전자가 많이 축적되었기 때문에 본 실험의 대상으로 선택하여 tagging 라인을 생산하였다.

그러나 동진벼는 내도복성 내냉성 내병성 등이 약해 최상의 tagging 대상은 아니다. 따라서 연구 1,2차년도는 동진벼를 자료로 하여 tagging 라인을 생산하였으나 향후 보다 다양한 유전자 자원을 가진 품종을 tagging 대상으로 선택하기 위해 형질전환이 잘되는 품종을 screening하였다. 그 결과 화영벼가 유전형질이 우수하고 형질전환 효율이 비교적 우수했다. 화영벼는 내냉성, 내도복성, 도열병저항성, 흰잎마름병저항성, 줄무늬잎마름병저항성 등 이 강해 insertion에 의한 inactivation tagging에 적합한 자료이다.

(2) 벼 형질전환

제작된 tagging 벡터들은 Agrobacterium을 이용하여 벼에 형질전환시켰다. 방법은 Hiei 등의 original protocol (1994)을 대폭 수정한 것으로 다음에 간략히 기술한다. 벼 성숙종자의 외피 (hull)를 벗긴 후 2,4-D 배지 (N6, 2 mg/L 2,4-D, 0.2% phytagel)에 놓아 scutellum 조직의 calli를 유도했다 (약 1개월). Sculletum calli는 벡터를 함유한 Agrobacterium과 20도에서 3일간 공동배양했다. 충분히 씻어낸 후 calli를 hygromycin (형질전환 선발 marker)과 cefatoxime (Agrobacterium 제거)이 들어있는 배지 (N6, 2 mg/L 2,4-D, 40 mg/L hygromycin, 250 mg/L cefatoxime, 0.2% phytagel)에서 선발했다 (1.5 개월). 선발된 calli를 shoot induction 배지 (MS, 2 mg/L kinetin, 0.1 mg/L NAA, 5% sucrose, 2% sorbitol, 1.6% agar)에서 재분화를 유도했다 (3주 - 1달). 뿌리분화배지 (MS)에서 식물체를 안정화시킨 후 (1-2주일) 토양으로 보냈다. 총 소요기간은 공동배양 후 약 3-4개월이었다. 동진벼의 경우 calli 기준으로 평균 50% 정도의 형질전환 효율 및 80% 재분화 효율을 확보하고 있다. 화영벼의 경우 calli 형성은 동진벼보다 우수하나 재분화 효율이 다소 낮다, 이를 극복하기 위한 실험이 진행중이다.

(3) Tagging 라인 생산 증식 및 보관

Tagging 라인 본 실험실이 속해있는 생명과학관 옥상에 있는 120평의 온실에서 키웠다. 온도 빛 광도 등을 조절할 수 있어 일년 내 벼 재배가 가능하다. 한 계절에 24,000 개체를 키워낼 수 있어 년간 최소 48,000 개체를 증식할 수 있는 시설이다. 그러나 온실에서는 종자 생산량에 한계가 있어 하절기에는 실험포장 700평을 이용하여 50,000개체를 증식하고 있다. 연구 1차 년도에 pGA1633을 이용하여 2000 여 라인을 구축하였으며 2차 년도에 pGA2144를 이용하여 20,000 여 라인을 구축하였다. pGA2715를 사용한 activation tagging은 10,000 라인이 구축되었다. 형질전환 당대의 수정률은 90%이었다. 각각의 tagging 라인의 종자를 독립적으로 -25도에 종자저장 냉동고에 보관하고 있다.

(4) Tagging 라인 분석

삽입된 외부 DNA는 종종 여러 copy가 들어가는 수가 있다. 벼의 tagging 라인을 분석한 결과 평균 2.2 copy가 들어가는 것이 확인되었으며 이 중 일부는 한 곳에 밀집해 들어가고 또 다른 일부는 각각 다른 염색체에 삽입되어 후대에서 분리되는 것이 관찰되었다. 각각 다른 염색체에 삽입되는 경우를 감안하면 tagging 라인 당 평균 1.4 copy의 insert가 들어가는 것이 관찰되었다. 따라서 2년 동안에 생산된 20,000의 tagging 라인으로부터 28,000의 독립된 tagging이 만들어졌을 것이다.

　

　

마. 기능성 유전자 동정 (identification)

　

(1) Insertional tagging 라인의 돌연변이 표현형 분석

Insertional 변이는 대부분 열성이다. 따라서 각각의 tagging 라인의 종자를 받아 15 개체를 심어 mutant 형질이 25-50%로 나타나는 라인들을 색출했다. 시험 포장 공간 및 연구인력의 한계성으로 매년 1000 라인을 screen 하고 있다. 아래의 표는 pGA1633으로 tagged 된 1598 라인을 분석하여 관찰한 돌연변이 빈도를 나타낸다
돌연변이 표현형 변이개체 수 빈도 (%)
height 115 7.2
pigment 152 9.5
lethal 18 1.1
leaf defect 18 1.1
spot 16 1.0

이러한 변이가 insertional tagging에 의한 것인지 아니면 조직배양과정에서 생길 수 있는 다른 요인 때문인지에 대한 연구는 돌연변이 표현형과 tagged된 DNA가 후대에서 함께 분리하는지를 분석함으로써 확인할 수 있다.

(2) Promoter trap 라인의 분석

pGA2144는 intron에 삽입되더라도 GUS와 fusion이 될 수 있도록 고안되어 있어 promoter trap을 효율적으로 하는 벡터이다. 다음은 20,000 여 tagging 라인의 GUS 효소반응 분석 결과이다. 잎 뿌리 등 영양 기관에서는 대략 2% 정도의 GUS tagging이 관찰되었고 미성숙 종자에서는 다소 낮은 효율이 관찰되었다. 그러나 성숙된 종자를 하루 동안 발아 꽃에서는 GUS 활성화가 높아 5%에 육박했다. 분석한 모든 기관에서 양성반응을 보인 라인도 있고 조직특이적인 라인도 있어 이를 종합해서 정리하면 대략 10%의 라인이 GUS 양성반응을 보였다. 잎에서 발현되는 라인의 70%가 관다발 주변에서 발현을 보였으며 mesophyll에서 특이하게 발현되는 것이 13% 정도이었다. 꽃에서는 외영(lemma)과 내영(palea)에서 발현되는 것이 대부분이었으며 수술 특이한 것이 8.6% 암술 특이발현을 보이는 것이 3%이었다.

기관

GUS positive (%)

잎

2.0

뿌리

2.1

꽃

4.8

미성숙 종자

1.6

성숙 종자

4.5

(3) 유전자 분리 (cloning)

Insertion에 사용한 DNA를 probe으로 tagged된 유전자를 비교적 간편히 분리할 수 있다. 첫째는 insert된 DNA 내의 primer와 degenerate primer set를 사용하여 PCR로 cloning하는 TAIL PCR 방법이며, 둘째는 EcoRI, HaeII, HindIII 등의 제한효소로 total genomic DNA를 자르고 ligation 한 후 inverse PCR로 cloning하는 방법을 사용하였다. PCR fragment는 ABI3100 automatic DNA sequencer로 서열을 분석하였으며, 읽힌 sequence는 DDBJ 및 Genbank dbase에 이미 등록된 유전자와의 상동성을 조사하였다. 또한 Monsanto의 벼 genome sequence dbase를 사용하였다.

20,000 여 라인 중 GUS positive를 보이는 라인을 집중적으로 분석하여 tagged된 유전자를 색출하였다. 별첨 3의 표는 GUS positive 라인에서 분리된 유전자 목록이다. 200여 개의 유전자가 검출되었으며 그중 반정도가 dbase에서 찾을 수 있었다. 그 중 반정도(53 유전자)가 타 유전자와의 상동성에 의해 기능이 유추되는 것이었으며 나머지는 novel 유전자로 보인다. 벼의 유전체 서열분석이 완료되면 보다 많은 유전자의 기능을 유추할 수 있을 것이다.

바. 벼의 분화 발달 연구

본 연구과제에서 생산된 tagging 라인 중 생장 이상을 보이는 변이를 색출하여 연구하였다. 이들은 GA에 의해 신장하는 GA sensitive한 group과 GA signal에 민감하지 않은 것들이 있었다. GA sensitive group은 GA 생합성에 결핍으로 보이며 GA insensitive group은 GA signal pathway 변이이거나 Brassinosteroid 같은 타 호르몬의 변이로 추정된다. 자세한 연구는 현재 진행 중이다.

　

4. 향후 연구 계획

가. 벡터 추가 제작

1단계에서 T-DNA 및 Ds를 이용하는 다양한 벡터를 제작하여 이들의 특성을 연구한 결과 일반적인 삽입 현상은 애기장대와 유사하였다. 1-2 copy의 T-DNA가 삽입된 것은 반정도 이며 나머지는 여러 copy가 한 곳에 모여서 들어갔으며 가끔 한 개 이상의 염색체에 삽입이 일어났다. T-DNA의 오른쪽 경계선은 비교적 잘 보전되어 있었으나 외쪽 경계선은 종종 손상되었거나 경계선에서 끝나지 않고 read-through가 일어난 것들도 많았다. T-DNA 삽입구조가 복잡할수록 tagged된 유전자의 분리가 어렵다. 따라서 T-DNA가 비교적 간단히 삽입될 수 있도록 벡터의 구조를 개량하고자 한다. 또한 다목적 벡터를 만들어 insertional 변이와 promoter trap 그리고 activation tagging을 동시에 가능하도록 할 예정이다.

(1) Insertional tagging 및 promoter trap 벡터 제작

1단계에서 tagging 라인을 구축하기 위하여 사용한 벡터는 binary Ti plasmid 이었다(Lee et al. 1999, Jeon et al. 2000b). Binary Ti vector는 식물로 전이되는 T-DNA 부위와 이를 박테리아에서 유지하는 벡터 backbone으로 구성되어있는데, T-DNA의 양쪽 끝에는 오른쪽경계(BR)와 왼쪽경계(BL)가 놓여있다. T-DNA의 전이체를 선발하기 위한 marker로 hygromycin (hph) 저항성 유전자를 사용하였다. 이 유전자의 발현을 조절한 promoter는 alpha tubulin 유전자의 것으로 특히 어린 조직에서 강하게 발현되어 형질전환체 선발에 적합하였다 (Jeon et al. 2000a). Promoter trap을 위해 1단계에서 구축한 벡터의 T-DNA BR 안에 reporter로 promoter-less GUS coding region을 넣었다. Trapping 효율을 높이기 위해 triple splice donors 및 acceptor sequence를 GUS 앞에 넣었다. 이에 따라 T-DNA insertion이 intron 혹은 exon 어디에 떨어져도 방향만 맞으면 reporter가 발현되게 고안되었다.

2단계에서는 1단계에서 개발한 벡터의 골격은 유지하되 유전자 tagging 효율을 증가시키기 위해 두 종류의 BL을 중첩해서 삽입하고자 한다. BL에서 T-DNA 삽입이 종료되지 않고 read through가 일어나는 것을 최소화하기 위해서이다. Nopaline type의 BL과 octopine type의 BL을 사용함으로써 DNA 서열 중복에 의한 불안정성을 최소화 할 예정이다. 또한 tagged된 유전자를 용이하게 분리하기 위하여 T-DNA 내에 colE1 origin of replication 및 betalactamase (bla, ampicillin 저항성 유전자) 유전자를 삽입할 예정이다. 이러한 요소들은 T-DNA에 의해 tagged 된 주변의 DNA를 E. coli에서 구출(rescue)할 수 있게 할 것이다. 또한 다양한 multiple cloning cites를 도입하여 IPCR을 수월하게 하고자 한다.

(2) Activation tagging을 포함한 다목적 벡터 제작

제1단계에서 본 연구실은 35S 4X enhancer가 벼에서도 작동한다는 것을 보여 주었다. 따라서 본 연구실에서는 35S 4X enhancer 서열을 insertional tagging vector에 삽입시킨 pGA2715를 제작하여 이를 이용하여 tagging 라인을 생산하였다. 이들의 activation 효용성은 앞으로 시험해야 할 사항이다. 2단계에서는 35S 4X enhancer와 insertional tagging을 겸한 다목적 벡터를 구축하여 이를 활용하여 tagging 라인을 생산할 예정이다.

나. Insertional promoter trap 라인 생산 및 분석

(1) 품종 선택

Tagging을 라인을 다량 생산하기 위하여 사용할 벼 품종은 형질전환 효율이 높은 품종이어야 한다. 1단계 연구에서 본 연구실은 형질전환 효율이 가장 좋은 품종인 동진벼를 사용하여 tagging라인을 생산하였다. 따라서 2단계에서도 동진벼를 사용할 예정이다. 그러나 동진벼는 내도복성 내냉성 내병성 등이 약해 최상의 tagging 대상은 아니다. 효율이 다소 낮으나 내냉성, 내도복성, 도열병저항성, 흰잎마름병저항성, 줄무늬잎마름병저항성 등 이 강한 품종인 화영벼를 병행하여 사용하고자 한다. 이 외에도 유전자 자원이 우수하며 형질전환 효율이 높은 품종을 조사하여 발견 시 사용할 예정이다.

(2) Insertional promoter trap 라인 생산

제작된 tagging vector들은 Agrobacterium을 이용하여 벼에 형질전환시킬 것이다. 본 연구실에서는 이미 효율이 우수한 형질전환 방법을 1단계에서 확립하였으므로 동진벼로 tagging 라인을 무난히 생산할 수 있을 것이다. 동진벼의 경우 calli 기준으로 평균 50% 정도의 형질전환 효율 및 80% 재분화 효율을 확보하고 있다. 그러나 화영벼의 경우 calli 형성은 동진벼보다 우수하나 재분화 효율이 낮아, 이를 높이는 조건을 연구하고자 한다. 형질전환의 효율이 계절에 따라 큰 차이를 보여 동절기에 좋은 효율을 보임으로 조직배양를 거친 tagging 라인은 일차적으로 본 실험실이 속해있는 생명과학관 옥상에 있는 120평의 온실에서 키울 것이다. 그러나 온실에서는 종자 생산량에 한계가 있어 하절기에 실험포장 700평을 이용하여 형질전환체의 종자를 얻을 예정이다. 2단계에서는 매년 10,000 라인의 insertional promoter trap 라인을 생산하여 이의 종자를 영하 30도 저장고에 장기 보관할 예정이다.

(3) Insertional promoter trap 라인 분석

Insertional promoter trap 라인은 GUS reporter의 activation을 GUS 효소반응에 의해 간편히 조사할 수 있다. 따라서 GUS activity를 tagging 당대에서 수행할 예정이다. 본 연구실에서는 꽃분화 및 발달을 중심으로 연구하고 있음으로 형질전환체의 꽃을 GUS assay할 예정이다. 1단계결과에 의하면 꽃에서 검증되는 GUS + 라인은 대략 5%로 추정된다. GUS + 라인은 꽃 조직 특이성을 조사하고 아울러 잎 뿌리 열매 등 다양한 기관에서의 발현 여부를 조사할 것이다. 또한 promoter trap 라인의 종자를 발아시켜 초기 종자의 GUS 발현 여부를 통해 유전자 trap 라인을 검증할 것이다. 매년 10,000 라인에 대한 조사를 실시할 예정이다.

다. Activation tagging 라인 생산 및 분석

Activation tagging 벡터는 한쪽은 activation tagging에 그리고 반대쪽은 promoter trap을 할 수 있고 동시에 inactivation이 되도록 고안할 예정이다. 따라서 이들 라인에 대한 GUS assay를 통해 promoter trap 분석을 실시할 예정이다. Activation tagging은 당대에서 표현형이 나타남으로 온실 혹은 논에서 변이체를 선발할 예정이다. 매년 10,000 라인을 생산하여 이들의 GUS assay 및 activation에 의한 변이형을 관찰하여 색출할 예정이다. 일단 변이체가 관찰되면 그 형질이 우성으로 다음 세대로 T-DNA와 함께 유전하는지를 분석할 것이다. 변이형과 tagging이 함께 co-segregation되면 T-DNA 주변 서열을 분리하여 tagged된 유전자의 기능분석연구를 할 것이다.

　

라. Trap된 유전자와 promoter 분리 및 기능 분석

(1) Tagging 유전자와 promoter 분리

GUS assay에 의해 positive로 검출될 라인은 적어도 5% 이상일 것임으로 insertional tagging 라인과 activation tagging 라인을 합친 20,000 라인을 분석하면 년간 1,000 라인 이상이 GUS positive 라인을 연구하게 될 것이다. 이들 중 꽃이나 열매 혹은 특정 기관에서 특이하게 발현되는 라인을 중심으로 tagged된 유전자를 분리할 예정이다. 이때 insertion에 사용한 T-DNA를 probe으로 하면 주변 DNA를 분리할 수 있다. 방법은 (i) insert된 DNA 내의 primer와 degenerate primer set를 사용하여 PCR로 cloning하는 TAIL PCR 방법과 (ii) 제한효소로 total genomic DNA를 자른 후 ligation하고 T-DNA 내의 primer를 사용하여 PCR로 cloning하는 IPCR 방법을 사용할 것이다. 본 연구실에서는 양쪽 방법에 대한 충분한 경험을 갖고 있어 별 어려움은 없을 것이나 T-DNA copy가 많은 경우 주변 DNA의 분리가 어려운 경우도 있다. 이 경우 GUS 발현 기관으로부터 mRNA를 만들고 이의 cDNA로 TAIL PCR을 하는 방법이 효율적이다. 또한 새로 만들어질 벡터에는 박테리아에서 증폭이 가능한 origin of replication이 들어 있어 total genomic DNA를 제한효소로 절편 후 ligation하여 E. coli에 형질전환해 rescue하는 방법을 사용할 수 있다.

(2) Tagging된 유전자와 promoter 분석

Tagging된 fragment는 ABI automatic capillary DNA sequencer로 직접 sequencing한다. 본 연구실에서는 PCR fragment를 cloning 과정 없이 직접 sequencing 하고 있다. 읽힌 sequence는 dbase 은행의 자료와 비교하여 이미 등록된 유전자와의 상동성을 조사한다. Monsanto의 rice genome dbase를 본 연구실을 사용하고 있으며 대략 50% 정도의 확률로 분리된 유전자의 서열을 Monsanto database에서 찾을 수 있다. 또한 RGP에서 빠른 속도로 벼의 유전자 서열 분석이 진행 중임으로 내년 초 경까지는 대부분의 벼 유전체 서열이 dbase에 축적될 것으로 예상되어 tagged된 유전자의 정체를 유추하는데 큰 도움이 될 것이다. Tagging된 DNA는 유전자의 절편임으로 이의 full length clone은 cDNA library에서 꺼낸다. 본 연구실에서는 다음과 같은 cDNA library를 이미 확보하고 있어 대부분의 cDNA를 색출하는데 어려움이 없을 것이다. shoot, 잎, 도열병균에 의해 induced된 잎, shoot apical meristem, 화아, 꽃의 각 기관, 미성숙 배, 배유, 종피. 필요에 따라 특수환경 처리된 재료의 cDNA library를 제작할 것이다. 다량의 EST clone이 RGP에서 분양이 가능하다. Promoter의 경우 genomic library에서 긴 절편의 clone을 분리하고 cDNA와 비교하여 위치를 확인한 후 조직특이 및 환경특이 element를 분석할 것이다.

유전자의 발현 양상을 RNA blot 분석 및 RT PCR 방법으로 유추할 것이며 필요에 따라선 RNA in situ hybridization 실험을 수행하여 GUS 발현 pattern과의 유사성을 연구할 것이다.

마. Tagging 라인 증식 및 돌연변이 분석

GUS positive 라인이 년간 적어도 1000 라인 검출될 것이다. 또한 다수의 activation tagging 라인이 표형형변이를 보일 것이다. 이들 라인은 모두 후대에서의 표현형 분리를 조사할 예정이다. 각 라인 당 15 종자의 껍질을 벗기고 살균 한 후 MS에서 발아시켜 종자의 변이 및 발아율 등을 정밀하게 조사할 것이다. 또한 어린 식물을 토양에 심어 2-3 주간 온실에서 키우면서 유모 표현형 변이를 관찰할 예정이다. 그 후 실험포장(논)에 심어 성숙시기까지 키우며 수형, 개화시기 등의 성체 표현형을 관찰하고 특히 개화시기 및 꽃 기관의 변이를 면밀히 조사할 것이다. 또한 수정률 및 종자발달을 조사할 예정이다. 이들 중 흥미로운 표현형을 보이는 라인은 DNA blot 분석을 통해 변이표현형과 T-DNA가 함께 segregation 하는지를 조사할 것이며 그러할 경우 T-DNA에 의해 tagging된 유전자를 분리할 것이다. T-DNA의 insertion에 의해 표현형이 나타나는 것의 확인은 tagging된 homozygotic 라인에 wild type DNA를 전이해서 complementation을 하는 실험과 antisense 및 RNAi 방법을 사용하여 mutant phenotype을 재현하는 실험을 통해 이루어 질 것이다. 필요에 따라선 돌연변이 라인의 생리 생화학적 분석을 통해 tagging된 유전자의 기능을 심도 있게 분석할 것이다.

5. 기대성과

가. 기술적 측면

유전자 tagging 기술의 세계적 수준확보하고 이를 유지하며, 벼의 유전자 분리 분석 기술의 향상 및 반자동화를 도모하며, 유용유전자 활용으로 우수 벼 품종 육성에 이바지한다. 이러한 기술과 자원은 보리 옥수수 밀 등 타 작물의 기능성 유전자 분리 분석 및 타 작물의 우수품종 육성에 기여할 것이다.

나. 경제 산업적 측면

벼의 전 세계 년간 생산량은 5억 톤에 달며 1,000조원의 가치이다. 한국은 120만 정보의 논에서 년간 8백만 톤의 쌀을 생산한다. 약 16조에 해당하는 소비자가치이다 (Khush and Toenniessen 1991). 10%의 생산량 증대는 년간 1조 이상의 수익증가를 가져온다. 또한 벼의 유용 유전자는 옥수수 보리 밀 등 타 작물에도 응용되어 우수품종 육성에 쓰일 수 있다. 본 연구 결과 분석될 수 있는 다양한 유전자 중 내병성 유전자의 개발 및 이를 이용한 품종 육성은 농약 사용을 줄일 수 있을 것이다. 우리나라는 식량의 75%를 수입한다. 이로 인해 년간 50만 불의 외화가 유출된다. 식물의 유용 유전자를 발굴 응용하는 기술은 우수 품종 육성 능력을 향상시켜 식량의 자급률을 늘일 것이다.

6. 활용방안

가. 벼 유전자 기능 분석 연구 활성

본 연구에서 생산될 tagging 라인을 보다 효율적으로 활용하기 위해 국내외 여러 연구실과 공동연구관계를 수립하여 연구를 진행할 예정이다. 국내 연구실의 국제 경쟁력을 고취하기 위해 향후 2년 간은 가급적이면 국내 학자들에게 우선권을 주고자 하며 외국과의 협력관계는 라인의 이전보다는 국내에 와서 공동연구를 수행하는 구도를 잡을 예정이다.

나. 우수 벼 품종 육성

본 연구에서 생산될 tagging 라인은 다양한 유용유전자를 분리하게 할 것이다. 이러한 유용 유전자를 활용하여 생산성 증대 벼 품종, 내병성 유전자를 활용한 환경친화형 벼 품종, 내한성 유전자를 활용한 통일대비 벼 품종, 기타 유용 유전자를 활용한 우수 벼 품종을 국내 전통 육종가들과 함께 육성 하고자 한다.

다. 유전자의 licensing

Monsanto, Syngenta, Dupont 등 다국적 기업들에 유용유전자의 기술이전

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