21세기 프론티어

1. 요약

본 연구실에서는 동진벼와 화영벼를 대상으로 60,000 라인의 T-DNA 삽입 변이주를 생성해 놓았다. 이를 최대한으로 활용하여 유용 유전자의 삽입변이를 색출하기 위하여 본 연구과제에서는 역유전 (reverse genetics) 방법을 사용하고자 한다. 이를 위하여 년간 20,000 라인씩 3년간 총 60,000 라인으로부터 DNA 풀을 만들고자 한다. 각 라인별 5립의 종자를 키워 50 라인씩의 DNA 풀을 만들고 이들을 섞어 500내지 1000 super 풀 만들 예정이다. 이미 분리된 삽입변이 유전자를 자료로 하여 DNA 풀에서 유전자 삽입변이를 검출하는 효율을 측정할 것이다. 이러한 효율은 PCR 조건, template DNA 농도, 풀 크기, primer의 서열, 길이, degeneracy, 농도, 삽입 위치에서의 거리 등에 의해 좌우 될 것임으로 다양한 조건을 연구하여 검출 효율을 극대화 할 예정이다. 본 연구실에서는 제작된 DNA 풀을 이용하여 식물분화관련 조절 유전자의 삽입변이체를 검색할 예정이다. 우선 꽃 및 여러 기관 발달에 중요한 역할을 하는 MADS box 유전자의 변이주를 색출할 예정이다. 벼에는 적어도 50의 MADS box 유전자가 있고, 유전자 내 보존 부위가 여러 곳에 있어 primer 제작이 용이하다. 또한 본 연구실에서는 MADS box 유전자의 기능연구를 지난 15년간 수행하여 왔음으로 삽입변이체의 확보는 기존의 연구를 크게 보완할 것으로 생각한다. 그 외에도 잎 및 meristem 발달에 중요한 역할을 하는 homeobox 유전자들의 변이체를 찾을 예정이며 장기적으론 벼의 분화관련 다수의 조절 유전자의 삽입변이주를 확보하여 유전자 기능 분석 연구를 수행할 예정이다. DNA 풀을 활용하고자 하는 두 번째 목적은 병저항성 관련 유전자의 변이체 색출이다. 특히 NBS-LRR family가 병저항성에 관련하는 것으로 알려져 있으며 다양한 LRR 유전자가 벼에 존재함으로 이 유전자들의 삽입변이주를 색출하고자 한다. 또한 병저항성 기작에 관련되는 것으로 추정되는 다양한 유전자의 삽입변이를 분리할 예정이다. 이 변이체들이 병저항성 기작에 어떠한 변화를 보이는지 후속 연구를 통해 기능분석을 하게 될 것이다. 본 연구에서 개발되는 DNA 풀은 다양한 유전자의 삽입 변이체를 색출하는데 매우 긴요한 자료일 것이며 따라서 타 연구실에서도 primer를 보내오면 삽입변이체의 유무를 검정한 후 해당 변이주를 색출하여 주는 서비스를 제공할 예정이다. 본 연구에서 연구된 분화관련 조절유전자 및 병저항성 관련 유전자 그리고 타 연구실에서 DNA 풀을 활용하여 색출할 다양한 유전자는 우수 벼 및 기타 화본과 작물 품종 육성에 기여할 것으로 기대한다.

Abstract

We have generated approximately 60,000 T-DNA insertional lines in japonica rice varieties, Dongjin and Whayoung. In this proposal, we plan to establish a reverse genetic method to maximize utilization of the mutant lines. DNA pools from 20,000 lines will be prepared each years for the three year granting period. We plan to make pools of 50 lines and super pools of 500 or 1000 lines. With the flanking sequences of several inserted loci that were already identified previously, the condition for isolation of T-DNA inserts will be studied. Factors such as PCR condition, pool size, concentrations of primer and template, primer sequence, primer length, primer degeneracy, and T-DNA insertion position will be examined. With the DNA pools we plan to study two classes of genes: regulatory genes that control plant development and genes that involve in disease resistance mechanism. MADS box genes are involved in controlling development of reproductive as well as vegetative organ development. There are at least 50 MADS box genes in rice and that control organ development. We plan to identify T-DNA insertions within the MADS box genes using the degenerated primers within conserved regions. We have been studying MADS box genes for the past 15 years and therefore identification of knockout mutants in MADS box genes will greatly enhance our efforts in understanding function of these important regulatory genes. We also plan to identify T-DNA tags within homeobox genes that play important roles in controlling development of various organs such as shoot apical meristem and leaf. Ultimately, we plan to identify T-DNA tags within a large number of regulatory genes that control plant development. The second class that we plan to isolated from the DNA pools is that involved in disease resistance mechanisms. A large number of the disease resistance genes belongs to the LRR family, which contains the conserved leucine rich region. Using the conserved sequences we plan to identify T-DNA inserts within the resistance genes. T-DNA tags within other genes that may involve in disease resistance mechanisms will also be isolated. The functional roles of these genes during pathogen infection will be examined. Since the DNA pools will be valuable in identification of knockout mutants of various genes, we plan to provide a service for identification of T-DNA tags to other scientists. Genes studied using the DNA pools will be valuable in generating improved cultivars of rice as well as other cereal crops.

2. 연구개발의 필요성

가. 연구개발의 중요성

1) 연구개발의 기술적 측면
인류의 역사를 두고 꾸준한 성장을 보여온 세계 식량 생산량 증산 추세는 1990년을 고비로 둔화되기 시작하였다. 인구증가에 의한 경작지감소, 이상기온 등의 이유도 있지만 가장 중요한 점은 전통육종의 한계성이다. 활용할 유전자원이 고갈되고 있기 때문이다. 이를 보완하기 위한 핵심 기술은 새로운 유용 유전자 자원의 개발이다. 예를 들어 강력한 내병성 유전자의 발굴은 기존 우수품종의 특성을 잃지 않고 비교적 짧은 시간 안에 신품종의 창출을 가능하게 할 것이다. 또한 유전자 전이 기술은 교배가 어려운 식물간에도 자유롭게 유전자를 교환할 수 있게 한다. 유전체 연구 (genomics)가 활발히 진행됨에 따라 유전자의 정체가 속속 들어 나고 있다. 그러나 이들의 기능을 전통적 방법으로 밝히는 일은 많은 시간 및 재원을 요구한다. 따라서 다양한 유전자의 기능을 포괄적으로 규명해내는 기술의 개발이 절실히 요구된다. 본 연구는 다양한 유전자의 기능을 빠른 속도로 분석하는 유전자 표식 (tagging) 기술의 핵심기술인 역유전 (reverse genetics)법에 의한 유전자 분리체계를 확립하여 타 연구실에 보급함으로서 유전체 분석 효율을 증대시키고, 본 연구실에서는 이를 이용하여 분화관련 유전자 및 병저항성 관련 유전자를 분리하여, 습득된 유용 유전자원을 우수 품종 육성에 활용하고자 한다.
2) 경제·산업적 측면
2025년 세계인구는 현재의 1.5배인 90억 정도로 예상된다. 또한 생활수준 증가로 현 기준의 3배 이상의 식량을 필요로 할 것이다. 특히 쌀을 주곡으로 하는 나라에서의 인구 및 생활수준 증가는 훨씬 빠를 것으로 예상된다. 이미 세계 곡물시장의 가격은 급속도로 증가되고 있다. 따라서 생산효율이 높고 자연환경에 강한 super 품종의 개발 없이는 증가되는 식량의 요구를 충족시킬 방법이 막연하다. 수천억불에 다다를 식물공학분야 산업은 조만간 생명공학의 핵심을 이룰 것으로 전망되고 있다. 이를 예상한 국제거대기업들 (Monsanto, Dupont, Syngenta, AgrEvo 등)은 사업 확장을 적극적으로 벌리고 있어 시장독점의 우려가 고조되고 있다. 이미 우리 나라에도 최근 Seminis, Syngenta 등의 다국적기업이 주요 종묘회사를 합병하여 국내 농업 경쟁력의 약화를 가속화 하고 있다. 유전자 자원을 선점하여 이를 활용하는 것은 다국적 거대기업의 독점을 견제하고 오히려 이들과 유리한 조건에서 협상을 할 수 있는 위치를 만들어야 할 것이다. 또한 유전자자원 발굴은 고부가가치 산업이며 동시에 많은 일자리를 창출하는 효과를 가져오게 한다. 문제의 초점은 누가 먼저 유용유전자를 확보하나 하는 점이다. 이제 유용 유전자는 특허에 의해 보호되고 상품화된다. 이를 선점하는 일은 21세기 생명공학산업 경쟁력의 핵심이다. 따라서 유용 유전자를 남보다 먼저 분리 분석하는 기술의 개발은 무엇보다도 중요한 사업이라 하겠다. 미국의 경우 유용 유전자 특허신청수가 1991년 4,000건에서 5년 사이에 100배 이상의 증가추세를 보였다. 본 연구실과제에서 구축할 DNA 풀은 역유전법을 사용하여 다양한 유용 유전자 자원을 빠른 속도로 분리할 수 있어 국가차원에서는 커다란 재산이며 학문적인 입장에서는 좋은 실험재료로 국제적 경쟁력을 가진 우수한 연구 그룹을 양성하는데 기여할 것이다.
3) 사회·문화적 측면
우리 나라는 75% (년간 300억불)의 식량을 수입한다. 이제 우리에게 남아있는 유일한 작물은 벼뿐이다. 유용 유전자를 확보하는 것은 벼농사의 경쟁력을 강화하여 수입의존도를 줄일 수 있으며, 농업의 효율성을 증대시켜 농촌을 보호하는데 기여할 것이다. 농업 경쟁력 강화는 국토의 효율적 이용이라는 점에서도 매우 중요하다. 일단 버려진 땅은 쉽게 황폐화하며 그것을 복원하는 것은 매우 힘든 작업이다. 식량을 무기화 한 레이건 대통령의 전략이 구 소련을 붕괴시켰듯이, 그리고 지금의 북한의 체재를 유지하는데 가장 어려운 점이 식량이듯이 한 국가의 국토는 농업을 위해 최대한으로 보존되어야 한다. 수입식품의 의존도를 낮추어 식생활의 건전도를 증가시켜야 한다. 수입식품은 그 생산과정 및 유통과정에서 소비자를 불안하게 하기 때문이다. 다이옥신파동이 그 한 예이다.

나. 지금까지의 연구개발 실적

1) 유전체 연구 (Genomics)
기존의 유용 유전자 개발 방법은 one-by-one 접근방법이었다. 이러한 연구가 우수한 공헌을 한 것은 사실이나 많은 시간과 인력을 요구한다. 인간의 3만 5천, 벼의 5만 유전자 기능을 기존의 방법으로 규명하려면 천문학적인 경비와 장시간이 필요하다. 따라서 유전체 전체의 구성 및 내용을 밝혀냄으로써 보다 효율적으로 유전자들의 기능을 분석하는 노력이 진행되고 있다 (Walbot, 1999). 이의 일환으로 애기장대 유전체 총 120 megabase의 서열이 분석되어 발표되었다(The Arabidopsis Genome Initiative, 2000) (http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/). 벼의 유전체 서열분석도 조만간 완료 공개될 예정이다.

2) 화본과 식물 유전체의 상동성: 벼는 화본과 식물로 화본과는 옥수수 밀 보리 등 세계 10대 작물의 대부분을 포함한다. 벼는 화본과 중 가장 유전체 크기가 작고 진정한 2n이어서 유전체 연구에 적합하다. 최근 유전자 mapping을 연구하던 중 화본과 식물의 유전체 구성이 서로 매우 비슷하다는 점이 발견되면서 벼 연구에 대한 값어치가 새삼스레 돋보이게 되었다 (Devos and Gale, 1997). 유전체 구조가 간단한 벼로부터 유전자 정보를 얻은 다음 이에 해당하는 유전자를 옥수수 밀 등 각각의 작물에서 분리 이용한다면 유전체 구성이 복잡한 작물의 유전자 연구에 큰 도움이 될 것이다. 또한 벼에서 연구된 유전자의 특허권은 이와 상동성이 높은 타 유전자도 포함시킬 수 있음으로 화본과 내 타 작물의 유전자 권리도 함께 포함될 것이다. 이에 따라 일본의 벼 연구 열기는 매우 크며, 미국 유럽 등에서도 벼에 대한 국가적 연구 과제 돌출이 제안되고 있으며 기업에서의 관심도 매우 높다.
3) 벼 유전체 연구: 벼 유전자 연구는 1985년 Rockefeller 재단의 Rice Biotechnology 사업으로 본격적으로 시작되어 미국을 비롯한 많은 연구실에서 활발히 진행되어 왔다. 그러던 중 1990년대 초 일본의 벼 유전체 서열 분석 연구 시작으로 가속도가 붙어 Rice Genome Research Program (RGP, http://dna.affrc.go.jp:82/)가 형성되어 2008년경에 전체 염기서열을 종료시킬 예정이었다. 한국에서도 농업과학기술원을 중심으로 유전체 서열 분석에 참여하고 있다. 그런데 2000년 4월 Monsanto에서 단독으로 벼의 전체 유전체 서열의 60%를 해독하였음 발표했으며 (Barry, 2001) Syngenta는 2001년 초 벼 유전체 서열 분석을 완료했음을 발표했다. 그러나 이러한 자료는 public에 공개된 것이 아니다. RGP는 원래의 계획을 수정하여 금년 내로 벼 유전체 서열분석을 완료 공개하는 것을 목표로 하여 진행중이다.
4) 기능 유전체 연구 (functional genomics): 유전체 연구가 생산해 내는 유전자 서열 정보만으로는 그 기능을 추측하기 힘들다. 지적권한을 주장하기 위해서는 기능을 밝혀야 한다. 다량의 유전자 기능을 효율적으로 분석하기 위해서 기능 유전체 (functional genomics) 분야가 새로이 등장했다. 유전자의 기능을 밝히는 방법은 insertional mutagenesis, antisense suppression, activation tagging 등 다양한 유전적 방법이 있으며 유전자 발현양상을 다량으로 분석하는 microarray 방법 및 단백질 수준에서 기능을 유추하는 proteomics 분야도 급성장을 하고 있다 (Bouchez and Hofte, 1998).
5) 삽입 변이 (Insertional mutagenesis): 유전자에 DNA 절편이 삽입되면 그 기능이 파괴된다. 이렇게 유전자 안에 알려진 DNA 서열을 삽입하는 것을 삽입변이라고 한다. 일단 변이된 유전자는 사용한 DNA를 bait로 하여 손쉽게 분리해 낼 수 있는 장점이 있어 선호되고 있다. 삽입변이를 유기하는데 Ac transposon과 T-DNA를 가장 보편적으로 쓴다 (Gierl and Saedler, 1992). 이러한 방법은 애기장대에서 성공적으로 활용되고 있다. 애기장대가 model 식물로 각광을 받게되면서 편이한 T-DNA 삽입변이 system이 개발되었고 이 식물의 형질전환이 용이해 지면서 활발히 진행되고 있다. Arabidopsis Seed Stock Center에서 T-DNA insertional line이 활용가능하며 그 외에도 다양한 실험실이 독자적으로 insertional line을 개발보급하고 있다. 또한 Ac transposon도 활발히 이용되고 있다.
6) 벼의 삽입 변이: Model system에서 축적된 지식을 벼에 활용하기 위한 전제조건은 효율적인 형질전환 방법의 개발이다. 약 7년 전까지만 해도 벼의 형질전환은 유전자총 (bombardment)에 의한 DNA 직접전달 방법이 주된 것이었으나, 효율이 낮고 전이 유전자가 불안정한 어려움을 겪고 있었다. 그러나 Agrobacterium에 의한 DNA 전이 방법이 개발되면서 벼의 연구가 활성을 띄기 시작했다 (Hiei et al., 1994). 그런데 초기의 벡터는 매우 크고 사용이 용이치 못한 결점이 있었으나, 본 실험실에서는 이를 극복하고 간편한 벡터를 만듦과 동시에 형질전환 방법을 극대화함으로써 벼의 유전자 기능을 분석하는데 필요한 기반을 구축하였다.
Ac/Ds를 이용한 벼 유전자 insertional mutagenesis는 지난 십여년간 노력해 왔음에도 불구하고 괄목할만한 진척을 보이지 못하고 있다 (Izawa et al., 1991). 그런데 최근 국내 학자(경상대 한창덕 교수)에 의해 벼의 Ac/Ds transposon 삽입 시스템이 개발되고있어 고무적이다. 본 실험실에서도 Ac system이 벼에서 성공적으로 뛰는 것을 확인하였다. 그런데 Ac는 일단 식물의 염색체 안에 삽입되면 지속적으로 움직이는 특성이 있다. 이를 이용하면 다양한 insertional mutation을 한 번의 형질전환으로 성취할 수 있는 장점이 있으나 돌연변이가 안정하지 못한 결점이 있다. 이러한 점은 Ds (결함된 Ac)를 이용하여 극복할 수 있으나 system 확립에 많은 시간이 요구된다. Ac와 Ds를 가진 각각의 line을 만든 후 이를 교배해서 Ds가 뛰게 한 뒤 selfing한 후대에서 Ac가 Ds에서 분리해 나가는 것들을 골라서 안정된 line을 만드는데 많은 노력과 시간이 든다. 또한 벼에서는 Ds가 후대에서 기능을 상실하는 문제성이 있다.
7) Promoter trap: Coding 부위를 갖고있는 reporter DNA가 유전자로 삽입되면 그 방향이 맞을 경우 reporter가 발현될 수 있다. 식물에서는 GUS reporter를 주로 쓰고 있는데 reporter의 발현양상을 조사함으로써 tagging된 promoter의 특징을 알 수 있다. Triple splice dobors 및 acceptors를 reporter 앞에 넣으면 trapping 효율이 높아진다 (Sundaresan et al., 1995).
8) 발달 조절 유전인자 연구: 본 연구실은 지난 15년간 벼의 MADS box 유전자를 연구해 오고 있다. 벼에는 적어도 50 종류 이상의 MADS box 유전자가 있는데 애기장대에서와 같이 꽃의 기관 발달에 관여하는 ABC 타입의 MADS box 유전자를 본 연구실에서 연구하였다. OsMADS4는 애기장대 B class 유전자의 하나인 P의 homolog이며 OsMADS16은 또 다른 B class 유전자인 AP3의 homolog이고, OsMADS3은 C class 유전자임을 밝혔다. 그 외에도 AGL2 family의 다양한 유전자를 분리하여 이들이 꽃발달에 중요한 역할을 하는 것을 연구하였다. 그 중 OsMADS1은 다양한 기능을 하는데 꽃 숫자 조절 및 palea/lemma 조절에 관여하는 것으로 밝혀져 지난해 Plant Cell에 cover 논문으로 다루었다. 본 연구실에서는 또한 영양조직(vegetative tissue)에서 발현하면서 꽃분화를 조절하는 다양한 MADS box 유전자 (OsMADS 14, 47, 51, 54) 및 뿌리 발달에 관여하는 MADS box 유전자 (OsMADS52) 등 20여의 MADS box 유전자를 분리하여 이들의 기능을 연구하였다. MADS box 유전자 이외에도 homeobox 유전자, Yabbi 유전자, bZIP 유전자, AP2 유전자 등 다양한 유전자가 식물의 분화를 조절하는 것으로 보고되었다. 최근 LRR 유전자 family가 식물의 발달에 중요한 역할을 하는 것을 발견되었다. LRR family는 식물의 분화 발달이외에도 병저항성 및 호르몬 신호전달 조절 등에도 관여하는데, 세포막에 부착되어 신호전달에 중요한 역할을 하는 것으로 추정된다. 애기장대의 clavata 유전자는 LRR family 중 한 member로 기관 숫자를 조절하는데, 본 연구살은 이에 상응하는 유전자를 벼에서 분리하여 antisense로 발현한 결과 벼의 꽃기관 숫자가 증가하는 것을 밝혔다. 이와 유사한 LRR family의 antisense 발현도 꽃기관 숫자에 변화를 미친 것으로 보아 다양한 LRR 유전자가 분화에 관여하는 것으로 추정된다.
9) 병저항성 유전자 연구: 저항성 벼 품종을 개발하는 것은 병을 예방할 수 있는 가장 경제적이고 효과적인 방법이다. 이를 위해서 병에 대한 강한 저항성을 보이는 형질을 가지는 품종으로부터 병 저항성을 조절하는 유전자를 분리하는 것이 요구된다. 또한 분리된 병 저항성 유전자를 이용하여 병 저항성에 관련된 신호전달기작을 규명하여, 이를 토대로 병을 조절하는 연구도 진행중이다. 벼에서 병 저항성을 조절하는 우성 유전자 분리를 위한 노력을 통하여 Ronald 교수 실험실에서는 흰잎마름병(Xanthomonas oryzae pv. oryzae race 6: Xoo)의 저항성 유전자인 Xa21을 분리하였다. 또한 아프리카에서 수집된 야생종 벼 Moroberekan으루터 도열병에 대한 지속적이며 강한 저항성을 부여하는 Pi5와 Pi7의 분리를 진행하고 있다. 이와 함께, 병 저항성의 조절과정에서 systemic acquired resistance (SAR)과 관련하여 중요한 기능을 수행하는 NPR1(non-expresser of PR genes)을 벼에서 분리하였으며, 이들의 과다발현이 병 저항성의 증가를 가져옴을 확인하였다. 또한 최근에 NPR1과 상호작용하는 PNI(proline-rich NPR1 interactor)를 yeast-two hybrid system을 이용하여 분리하였으며, 이들을 과다발현하는 벼가 병 저항성을 감소시키는 결과를 가져와 아마도 PNI는 병 저항성의 negative regulator로서 잠정적으로 추정되고 있다. Xa21에 의한 병 저항성의 경로를 규명하기 위해서 Xoo로부터 분비되는 avrXa21이라는 avirulence factor를 찾는 연구와 함께 벼 세포내에서 Xa21과 상호작용하는 단백질을 분리하는 연구를 진행하고 있다. 현재까지 XB1 (Xa21 binding factor 1)과 XB2라는 두개의 서로간에 매우 유사성이 높은 kinase 단백질이 Xa21의 신호전달에 관여할 가능성이 높은 것으로 추정되고 있다.

다. 앞으로의 전망

유전체 연구는 총체적으로 발달하고 있다. 유전체 내의 전체 유전자를 대상으로 연구를 하는 것이 효율적이고 생산적이기 때문이다. 이를 위하여 유전체를 체계적으로 분석할 수 있는 자료와 이를 효율적으로 활용할 구조 및 재원이 필요하다. 벼의 경우 연구 여건이 타국에 비해 크게 뒤지지 않으나 국내 연구팀이 아직 어린 편이어서 이들을 키우는 일이 시급해 보인다. 삽입변이주 및 DNA 풀 등 우리만이 갖고 있는 자원을 활용한다면 국제 경쟁력 있는 연구팀이 여럿 성장할 것으로 전망된다.

3. 연구개발의 목표 및 내용

가. 연구개발의 최종목표

벼의 유용 유전자를 역유전 (reverse genetics) 방법으로 분리하는 재료와 방법을 구축하여 삽입변이주를 효율적으로 활용하게 하며, 본 연구실에서는 이를 이용하여 발달 관련 유전자 및 병 저항성 관련 유전자를 분리하고 이를 활용하여 우수 벼 품종 육성에 기여하고자 한다. 1단계에서는 이미 수립된 삽입 변이주를 사용하여 연구하며 2단계에서 추가로 삽입 변이주를 생산하여 역유전 연구를 가속화시킨다.

나. 연차별 연구개발 목표 및 내용

1단계 (2001.9-2004.6)
1. 본 연구실에서 생산 이미 생산된 삽입변이체 60,000 주로부터 DNA pools을 제작하고 이로부터 유전자의 삽입 변이체 색출 효율 극대화 연구 수행.
2. 발달관련 조절유전자 (MADS box, homeobox 등)의 삽입변이주 분석 및 유전자 기능 연구
3. 병저항성 기작 관련 유전자 (LRR receptor family)의 삽입변이주 분석 및 유전자 기능 연구

예상 결과물
1.삽입변이체 60,000 라인으로부터 DNA 풀 제작
2.유전자 기능 탐색 80종
3.논문 6편 (SCI impact factor 3 이상)
4.특허 출원 2건

4. 연구방법

가. DNA 풀 제작

본 연구실에서 이미 축적해 놓은 60,000 라인의 T-DNA 삽입 변이주로부터 매년 20,000 라인 연차적으로 DNA 풀을 제작한다. 1차년도에는 50 라인씩의 DNA 풀을 만들 예정이다. 제작될 DNA의 양과 질을 균일하게 조절하기 위하여 변이체의 종자 5립을 살균처리 후 7일간 온실에서 키운 후 DNA를 만들 예정이다. 삽입변이체의 종자발아율은 90%이고, 각 풀(50라인 x 5립 = 250개체)에서 만들어질 DNA 양은 평균 0.5 mg으로 예비 실험되었다. 한번 PCR 실험에 사용할 DNA 량을 5 ng으로 추정하면 100,000회의 PCR을 수행할 수 있는 DNA가 제작되는 셈이다. 총 20,000라인을 50개씩의 풀로 제작하면 400개의 풀을 만들어야 한다. 2차 년도부터는 1차 년도의 경험을 바탕으로 풀 크기를 조절할 예정이다. DNA 제작은 일회용 tube를 사용하고 clean bench에서 수행하여 DNA 오염을 극소화 할 것이다. 부득이하여 용기를 재 사용할 경우 용기를 산성용액으로 처리할 것이다.

나. DNA 풀 분석

만들어진 DNA의 super 풀을 만들 예정이다. 풀을 10개씩 섞으면 500의 super 풀이 생기며 20개씩 섞으면 1000의 super 풀이 생긴다. Super 풀의 규모를 어떻게 하느냐는 삽입 변이체를 색출하는 효율을 결정하는데 중요한 factor이다. 애기장대의 경우 2025개의 super 풀을 대상으로 degenerate PCR primer를 사용 삽입변이체를 screen 하였다 (Young et al., 2001). 벼는 애기장대보다 유전체가 3-4배 큼으로 벼에서는 500 내지 1000개의 super 풀이 작용하는지를 분석할 예정이다. 본 연구실은 삽입 부위의 염기 서열이 결정된 라인들을 다수 (수백 라인) 확보하고 있다. 따라서 이를 활용하여 super 풀 크기를 결정하는 연구를 진행할 예정이다. Template와 primer의 농도, 풀 크기, primer 서열 및 길이, primer degeneracy, 삽입 위치와의 거리 등 다양한 factor가 색출 효율에 영향을 미칠 것임으로 이를 연구할 예정이다.
일단 target 유전자가 super 풀에서 검색되면 각각의 풀을 PCR하여 positive 풀을 찾아내는 것은 어려운 일이 아닐 것이다. 그런데 각각의 풀에서 특정 변이주를 색출하려면 50 라인의 DNA를 만들어야 한다. 이를 각각 수행하려면 많은 노력이 요구된다. 따라서 DNA 풀을 세로 조합으로 만들어 사용하면 효율이 증대될 것이다.

다. 발달 관련 유전자 삽입 라인 분리 분석

분화를 조절하는 유전인자의 변이는 식물의 분화와 발달을 연구하는데 귀중한 자료이다. 벼에서 분화를 조절하는 것으로 예상되는 유전인자 중 가장 먼저 연구하고자 하는 것은 MADS box 유전자이다. 아직 벼 유전체 서열 분석이 종료되지 않아 정확한 숫자는 알 수 없으나 애기장대에서 50개에 육박하는 MADS box 유전자들이 밝혀졌고 (Alvarez-Buylla et al., 2000) 벼에서 30개 이상의 유전자가 이미 분리된 점 등으로 미루어 보아 적어도 50 이상의 MADS box 유전자가 벼에 존재할 것으로 추정된다 (Chung et al., 1994, Shinozuka et al., 1999).
MADS box 유전자는 단백질의 기능에 따라 네 부위로 나뉘는데 N terminal 끝 쪽에 있는 MADS box 부위가 가장 잘 보존되어 있다. 그 외에 유전자의 중앙에 존재하는 K box 부위도 어느 정도 보존된 부위가 있으며 C terminal에도 subfamily 별로 상동성이 높은 부위가 있다. 따라서 이 보존 지역에서 degenerate한 primer를 제작하면 다양한 MADS box 유전자를 한꺼번에 screen 할 수 있을 것이다. MADS box 단백질은 200 내지 250 아미노산 정도로 비교적 짧으나 intron이 6-7개가 있고 특히 첫 번째 intron의 길이가 1-5 kb 정도로 길어 (Jeon at al., 2000) 한 종류의 primer 제작으로 삽입변이를 색출하는 것은 어려우며 첫 번째 intron의 양쪽에서 primer를 제작하여야 T-DNA 삽입 색출 가능성이 높아진다. 따라서 MADS box 유전자의 primer는 MADS box 부위, K box 부위, C terminal 부위 세 곳에서 양쪽 방향으로 만들어 총 6개가 되며 T-DNA primer는 양쪽 border에서 밖으로 나가게 고안할 예정이다. MADS box 유전자 family의 삽입 변이체를 역유전 방법으로 색출하려면 최대 12번의 PCR을 수행하여야 한다.
식물에서 homeo box 유전자는 옥수수의 잎 발달을 조절하는 knotted mutant에서 처음 발견된 후 (Hake et al. 1989) 다양한 식물 발달에 관여하는 것이 알려졌다. 벼에서도 homeo box 유전자가 meristem 발달에 관여하는 것이 알려졌다. 옥수수 knotted 1의 homolog인 Oryza sativa homeobox 1 (OSH1)은 다양한 분화과정에 관여하는 것이 알려졌고 (Matsuoka et al., 1993) 또 다른 벼 homeobox 유전자인 OSH15은 절간발달에 관여하는 것으로 보고되었다 (Sato et al., 1999). 벼에는 적어도 40개의 knotted1 타입 homeobox 유전자가 있는데 이들의 발현양상이 매우 다양한 것으로 보아 서로 다른 특이한 기능을 갖을 것으로 예상된다 (Sentoku et al., 1999). 그러나 이 유전자들의 돌연변이가 결여되어 있어 기능분석이 어렵다. 본 연구에서는 homeobox 유전자의 보존 부위에서 primer를 제작하여 삽입변이체를 색출하여 이들이 식물의 발달에 미치는 영향을 연구할 예정이다. 이 외에도 다양한 유전자가 식물의 분화를 조절하는데 이들을 2-3 단계에서 knockout 변이를 색출하고 기능을 분석할 예정이다.

라. 병저항성 관련 유전자 분리 분석

병원균에 대한 저항성은 많은 경우에 우성 또는 반우성 저항성 유전자에 의해서 결정되며, 이들 유전자로부터 생산된 단백질들은 receptor로 작용하여 병원균으로부터 분비된 avirulence factor라는 ligand를 정확히 인식하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 밝혀진 식물 저항성 유전자의 대부분은 nucleotide binding site (NBS) domain과 leucine rich repeats (LRR) domain을 가진다. 따라서 NBS-LRR 저항성 유전자에 보존된 아미노산부위로부터 degenerate primer를 제작하여, 이들 유전자 family에 T-DNA가 삽입된 변이체를 PCR에 의한 역유전 방법으로 색출할 예정이다.
애기장대 NPR1(non-expresser of PR genes)은 식물에서 systemic acquired resistance(SAR)을 조절하는 매우 중요한 유전자이다. 최근에 공동연구를 하고자 하는 Pam Ronald 연구실에서는 벼에서 NPR1과 상동성을 가지는 NH1 (NPR1 homolog 1), NH2와 이들과 상호작용하는 PNI (proline-rich NPR1 interactor)을 분리하여 그 기능을 연구하고 있다. 이를 위해서 분리된 유전자의 염기서열을 이용하여 PCR primer를 제작하여 이들 유전자의 삽입변이체를 역유전방법으로 찾고자 한다.
LRR, Kinase라는 두 종류의 domain을 동시에 가지는 특이한 병저항성 유전자 Xa21의 신호전달기작을 연구하기 위해서 Xa21의 kinase domain과 상호작용하는 유전자를 yeast-two hybrid 기법에 의해서 분리하여 XB1 (Xa21 binding factor 1), XB2라고 명명되였다. 이들의 정확한 기능과 식물체내에서의 상호작용을 확인하기 위해서 먼저 이들 유전자에서 T-DNA 삽입에 의한 변이체를 역유전방법에 의해서 찾을 예정이다.

5. 국제 공동연구 개발 추진계획

벼의 병저항성 유전자의 연구 중요성에도 불구하고 이를 유전체 수준에서 연구하는 연구실이 국내에서 희박하다. 다국적 기업과 미국 일본 등 선진 연구실에선 병저항성 관련 유전체 연구가 매우 활발하여 우리도 이를 적극적으로 대처하지 못하면 중요 유전자 자원을 잃을 가능성이 높다. 본 연구실에서 생산한 유전자 삽입변이주는 동진벼 이외에도 병 저항성 유전자원이 좋은 화영벼를 대상으로 하였음으로 병저항성 관련 유전자를 색출하기에 적합한 자원이다. 본 연구실을 그동안 분화에 초점을 맞추어 연구를 하여온 관계로 병저항성 관련 연구를 단독으로 수행할 능력이 부족하다. 그러나 과제의 중요성 및 시급성을 감안하여 병저항성 연구가 활발한 외부 연구실과 공동연구를 통해 유용 유전자를 신속히 색출하여 연구하고자 한다.

공동연구자는 University of California, Davis의 Pamela Ronald 교수로 흰잎마름병(Xanthomonas oryzae pv. oryzae race 6)의 저항성 유전자인 Xa21을 분리하여 연구하고 있다. 이 연구는 벼에서 병저항성 유전자를 최초를 분리했다는 점과 저항성 유전자에 LRR 부위 및 kinase 부위가 있다는 점이 특이하다. 마침 Ronald 교수 연구실에는 한국인 postdoc(전종성 박사)이 병저항성 유전자의 map based cloning 연구를 수행하고 있어 본 연구실과 유기적인 관계를 형성하여 효율적인 연구를 수행하는데 중요한 역할을 할 수 있을 것이다.

공동연구는 저항성 유전자의 삽입변이주 선발 및 유전자 분리는 본 연구실에서 그리고 선발된 변이주의 병저항성 변화 검정 및 분리된 유전자 특성 연구는 공동연구를 통해 이루어 질 것이다. 이를 위하여 Ronald 교수를 단기간 방문초청하며 그 실험실의 Postdoc 한 명을 한국에 매년 1개월 간 파견하여 저항성 검정 실험을 하게 하며, 분리된 유전자의 mapping 및 기존의 저항성 관련 유전자와의 관계, 병저항성 기작 연구 등은 공동연구실에서 수행한다. 이러한 기술을 습득하기 위하여 본 연구실에서는 1명의 대학원생을 1개월 간 파견한다 (첨부 자료 참조).

삽입변이주는 병저항성 관련 가능성이 있는 소수 특정 라인에 한하여 미국 USDA의 허락을 받고 본교와 material transfer agreement를 작성한 후 공동연구실로 분양한다.

6. 기대성과

가. 학술적 측면

벼의 T-DNA 삽입 변이주의 다량 분석을 역유전 방법으로 추구하여 유용한 유전자의 knockout을 신속하게 분리할 수 있는 시스템을 개발해 놓으면 이를 활용하여 다양한 연구가 진행될 것으로 예측된다. 애기장대의 삽입변이체를 역유전 방법으로 색출하여 연구에 활용하는 것은 매우 평범한 기술이 되었다. 벼에서도 이러한 기술이 확립되어 많은 연구자에게 도움이 될 것을 기대한다.

나. 경제·산업적 측면

DNA 풀을 활용하여 역유전 방법에 의해 유전자를 분리하는 것은 경제적 및 산업적 가치가 매우 높다. 그러나 본 연구실에서는 DNA 풀을 산업화하는 것을 우선은 지향하고 실경비 정도를 부과하여 보급함으로써 타 연구실의 삽입변이체 사용을 촉진하고자 한다. 본 연구실에서 DNA 풀을 활용하여 분리할 발달조절 유전자 및 병저항성 유전자는 우수 품종 육성에 활용할 수 있는 것들이 색출될 것으로 기대한다.

7. 활용방안

벼 삽입변이체와 DNA 풀을 사용하고자 하는 연구실이 많을 것으로 예상된다. 이에 따라 본 연구실에는 삽입변이체를 검색 서비스를 제공할 예정이다. 서비스를 원하는 연구자가 고안한 primer를 기탁하면 본 연구실에서는 super 풀을 screen하여 줄 예정이다. 이에 소요되는 경비는 소비자 부담이어야 할 것이다. 본 연구실의 삽입변이주 집단 안에 knockout 유무를 우선 검사하여 통보하며 변이체가 있는 경우 추가의 실험을 통해 이에 해당되는 라인을 선별할 예정이다. 해당 삽입 변이주는 material transfer agreement를 한 후 연구자에게 보급할 것이다.

본 연구실 자체에서 DNA 풀을 사용하여 색출한 삽입변이체에서 기능이 분석된 분화관련 및 병저항성 관련 유전자들은 특허로서 보호하고 벼의 품종 육성에 활용하도록 하며 옥수수 밀 등 타 작물에도 활용 가능성이 높을 경우 기술이전을 할 예정이다.

8. 참고문헌 및 참고사항

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